Epidemiologii spun că testele în masă pentru SARS-CoV-2 – care necesită milioane de eșantioane pe țară pe săptămână – este cea mai practică cale de ieșire din criza actuală. Permite oficialilor să-i izoleze pe cei care testează pozitiv, să limiteze răspândirea bolii și să ajute la stabilirea momentului în care este sigură relaxarea restricțiilor, scrie jurnalul științific Nature. Sursa Zilei publică traducerea analizei Nature, deoarece prezintă cele mai inovative tehnologii de testare și clarifică neajunsurile actualei abordări globale a pandemiei.
Dar țările reușesc cu greu să crească numărul de teste. Un motiv este că testul standard pentru detectarea SARS-CoV-2 – bazat pe o tehnică de laborator principală numită reacție în lanț a transcripției inverse a polimerazei sau RT-PCR – necesită personal instruit, consumabile chimice specifice și instrumente costisitoare care necesită ore întregi de muncă pentru rezultate și sunt adesea disponibile numai în laboratoare care oferă servicii de rutină, centralizate. Acest lucru limitează numărul de teste care pot fi efectuate, în special în țările în curs de dezvoltare. Chiar și în regiuni înstărite, cum ar fi Statele Unite, furnizorii au raportat o insuficiență severă de kituri de testare și materiale necesare – de la tampoanele nazale până la reactivi chimici – din cauza problemelor lanțului de aprovizionare. Creșterea rapidă a testelor fiabile s-a dovedit rapid dificilă: testele RT-PCR timpurii dezvoltate de centrele americane pentru controlul și prevenirea bolilor nu au funcționat, de exemplu, ducând la o serie de întârzieri.
Dincolo de PCR
Testele pentru coronavirus se încadrează în două mari categorii: cele care detectează materialul genetic de la virusul sau moleculele de pe suprafața sa, care sunt utilizate pentru a diagnostica dacă o persoană are o infecție și cele care se ridică în prezența anticorpilor, dezvăluind dacă cineva a fost infectat și a dezvoltat un răspuns imun la virus. Testele de anticorpi au o utilizare diagnostică limitată: dacă o persoană este testată devreme în cursul infecției, atunci când răspunsul imun al acesteia este încă acumulat, este posibil ca testul să nu detecteze anticorpi. Și pentru că persoanele cu coronavirus sunt cele mai infecțioase la debutul simptomelor, testele pentru materialul viral sunt cruciale pentru a identifica cine ar trebui să fie izolat. În Statele Unite, testele de diagnostic viral sunt majoritare.
Grupurile de cercetare din întreaga lume concep acum teste care depășesc PCR. Zeci de metode de diagnostic sunt în curs de dezvoltare, toate detectând material viral, dar în moduri diferite: unele sunt modificări pentru RT-PCR care fac testul mai rapid sau mai ușor de utilizat; alții folosesc instrumentul de editare a genelor CRISPR pentru a accepta fragmente genetice de SARS-CoV-2; iar unii identifică virusul folosind proteine care stau la suprafața sa. Multe dintre aceste teste, cum ar fi Zhang, sunt validate folosind probe clinice, iar unele sunt deja în clinică. În aprilie, Institutele Naționale de Sănătate din SUA au alocat 1,5 miliarde de dolari pentru dezvoltarea testelor coronavirusului, urmărind să permită milioane de teste pe săptămână până la sfârșitul acestei veri. „Cu cât putem veni cu o soluție”, spune Zhang, „cu atât mai repede putem relua o formă de normalitate”.
Metoda lor adaugă „coduri de bare moleculare” individuale la eșantioanele clinice înainte de punerea în comun și folosirea secvențării de generație următoare pentru a le decoda simultan. Codurile de bare permit apoi cercetătorilor să identifice probele testate pozitiv. Alte echipe au lansat detalii despre abordări similare de testare în masă, inclusiv firma de start-up biotehnologie Octant din Emeryville, California, și cercetătorii de la Broad Institute.
Deoarece secvențiatorii ADN pot citi sute de milioane de fragmente de ADN simultan, cercetătorii estimează că testele bazate pe secvențiere ar putea fi folosite pentru a analiza până la 100.000 de probe într-o singură rundă. În schimb, o mașină PCR standard poate testa doar zeci sau sute de probe în același timp. Dar aceste teste de secvențare durează timp – cel puțin 12 ore – și necesită echipament specializat în instalații centralizate. Obținerea de milioane de eșantioane livrate în aceste facilități nu este banală.
Cel mai promițător mod de a efectua un număr mare de teste, spune Mitchell O’Connell, biochimist la Universitatea din Rochester din New York, va fi utilizarea unui amestec de metode care se bazează pe diferite instrumente și lanțuri de aprovizionare, astfel încât o cerere bruscă la nivel mondial nu va epuiza niciun material cheie. „Orice nouă tehnologie care este în măsură să extindă numărul de teste pe care le putem face este o veste bună”, spune el.
Dacă aceste teste sunt gata în curând, ar fi o veste bună pentru pandemia actuală și pentru focarele viitoare. Multe dintre testele în dezvoltare ar putea fi adaptate cu ușurință la un agent patogen emergent, odată decodificată secvența sa genetică, spune Isabella Eckerle, virolog la Universitatea Geneva din Elveția. Eckerle spune că, chiar dacă testul ideal încă nu există – unul exact, rapid, ieftin și ușor de utilizat și de extins – „există multe lucruri în dezvoltare care ar putea fi utile.”
Testul de diagnostic standard de aur, care folosește RT-PCR, funcționează căutând un eșantion prelevat din celule sau lichide din nasul sau gâtul unei persoane pentru o secvență genetică specifică din SARS-CoV-2. Dacă se găsește secvența virală, tehnica o amplifică la niveluri care pot fi detectate. În primul rând, ARN-ul virusului este transformat în ADN. Apoi, secvențe scurte de ADN proiectate cunoscute sub numele de primer efectuează mai multe acțiuni. Unele etichetează secțiuni specifice ale codului genetic viral pentru a ajuta la duplicarea secvenței de milioane de ori, folosind un proces care necesită încălzire și răcire repetată. Această amplificare face să fie ușor de detectat chiar și minuscule cantități de virus, până la o singură moleculă de ARN per microlitru. Alți primeri adaugă etichete pe catenele de ADN amplificate. Aceste etichete eliberează un semnal fluorescent care este măsurat de un computer, marcând prezența virusului (a se vedea „Tehnici de testare: standardul de aur”). Testele standard RT-PCR pentru coronavirus durează între una și patru ore și pot fi exact până la 100% – deși acuratețea oricărui test de diagnostic depinde de mulți factori, cum ar fi modul și momentul în care a fost prelevat un eșantion.
Diferite abordări vizează reducerea timpului necesar obținerii unui rezultat al testului, cum ar fi prin amplificarea ADN-ului la o temperatură constantă, ceea ce elimină necesitatea unor runde succesive de încălzire și răcire. Unele dintre acestea sunt analize preexistente care sunt personalizate pentru a detecta SARS-CoV-2. De exemplu, companiile americane Cepheid și Abbott au dezvoltat teste de coronavirus care rulează pe platforme hardware de dimensiunile unui prăjitor de pâine și durează mai puțin de o oră pentru a le efectua. Cu toate acestea, reactivii și platformele pot fi costisitoare, și Abbott a avertizat că utilizarea unei soluții specifice pentru diluarea eșantioanelor pacienților poate bloca detectarea virusului.
Câteva alte teste se bazează pe o tehnică numită amplificare izotermă mediată în buclă (LAMP), care funcționează, de asemenea, la o temperatură constantă și a fost folosită pentru a identifica virusuri precum Zika. LAMP se bazează pe două enzime – una pentru a converti ARN-ul viral în ADN, și alta pentru a copia ADN-ul, precum și un set de patru până la șase primeri scurti, concepute pentru a recunoaște diferite fragmente ale genomului viral. Aceste fragmente nu numai că ajută la începerea copierii, la fel ca în RT-PCR, dar permit, de asemenea, catenele ADN recent copiate să formeze structuri buclate care pot fi amplificate mult mai rapid decât în PCR standard (vezi „Loop the loop”). Cu toate acestea, este mai puțin precis și doar câteva zeci de probe pot fi rulate simultan.
Deoarece tehnica nu are nevoie de instrumente speciale, ea poate fi folosită în teren și în regiuni care nu dispun de echipamente avansate, inclusiv zone îndepărtate și centre de refugiați, spune Vicent Pelechano, un expert în genomică la Institutul Karolinska din Stockholm, care a co-dezvoltat un test bazat pe LAMP pentru SARS-CoV-2. „Nu-ți trebuie decât o eprubetă care conține grunduri, o pipetă, o placă fierbinte și o oală cu apă”, spune el. Un singur test ar costa aproximativ 1 dolar – fără a conta munca.
În laborator, Pelechano și testul bazat pe LAMP al colegilor ar putea detecta mai puțin de 10 copii ale unui genom SARS-CoV-2 în cel mult 40 de minute. Cercetătorii au făcut apoi teste folosind probe de la 248 de persoane cu infecție coronavirus confirmată și au putut detecta virusul aproape 90% din cazuri. Pelechano recunoaște că testul s-ar putea dovedi a fi mai puțin precis pentru unele probe, precum cele contaminate cu sânge.
Dar în unele locuri, compensarea la capitolul exactitate ar putea merita. Țările cu venituri mici și zonele afectate de război nu au suficiente mașini PCR pentru a efectua testul de diagnostic standard pentru coronavirus, spune Nabil Karah, un microbiolog clinic la Universitatea Umeå din Suedia. Karah lucrează cu alți oameni de știință și cu echipa lui Pelechano pentru a-și aduce testul bazat pe LAMP în Siria pentru a crește capacitatea de testare locală.
Accelerarea testelor
La începutul lunii martie, în timp ce autoritățile se străduiau să țină pasul cu răspândirea coronavirusului în Statele Unite, inginerul chimic Howard Salis s-a simțit obligat să ajute. Pentru a accelera testarea, a decis să încerce o abordare puternică de secvențiere care a revoluționat ritmul cercetării în domeniul genomicii. Aproximativ trei săptămâni mai târziu, echipa lui Salis de biologi de la Pennsylvania State University din University Park a venit cu o modalitate de a testa probe de la aproape 20.000 de oameni într-o singură rundă.
Un alt mod în care cercetătorii încearcă să aducă testele în masă este să elaboreze analize care ar putea fi utilizate în centrele de testare temporară, centre de testare drive-through și chiar în casele oamenilor.
Cel puțin două echipe profită de tehnologia de editare a genelor CRISPR pentru a alimenta astfel de teste. De exemplu, cercetătorii conduși de Zhang au dezvoltat un test de coronavirus care poate fi rulat într-o singură eprubetă în aproximativ o oră. Dar încă necesită încălzirea eșantionului la aproximativ 65 ° C și nu este la fel de sensibilă ca o analiză bazată pe PCR. „Este în regulă, pentru că este mult mai ușor de utilizat”, spune Zhang. Când a fost testat de mai multe ori pe probe de la 12 persoane infectate cu coronavirus, testul a detectat virusul cu aproape fiecare ocazie.
Cercetătorii programează o moleculă de ghidare pentru a se fixa pe o anumită întindere a genomului SARS-CoV-2 (metoda denumita SHERLOCK). Dacă molecula de ghid găsește o potrivire, o enzimă CRISPR generează un semnal care poate fi detectat fie ca o strălucire fluorescentă, fie ca o bandă întunecată pe o manșetă de hârtie. La 6 mai, Administrația SUA pentru Alimente și Medicamente (FDA) a autorizat de urgență un test SHERLOCK, realizat de firma de biotehnologie Sherlock BioSciences din Cambridge, Massachusetts (din care Zhang este co-fondator), iar compania s-a asociat cu un producător pentru producerea în masă a kiturilor.
Mammoth Biosciences, o companie de diagnosticare co-fondată de pionierul CRISPR, Jennifer Doudna, de la Universitatea din California, Berkeley, solicită, de asemenea, o autorizație de utilizare în regim de urgență pentru testul său de coronavirus CRISPR6, a declarat Janice Chen, directorul tehnologic al Mammoth și co-fondatorul Janice Chen. Testul se bazează pe un rezultat anterior care arată că tehnologia poate detecta papilomavirus uman. Compania, cu sediul în San Francisco, California, încearcă acum să facă testul destul de simplu și ieftin pentru oricine să-l folosească acasă, spune Chen. „Scopul final este să ducă diagnosticul direct la consumatori – PCR nu a putut să meargă acolo”, spune ea.
Guozhen Liu, bioinginer în cadrul Universității din New South Wales din Sydney, Australia, spune că tehnologii precum CRISPR ar putea „schimba jocul” în actuala pandemie. Mulțumită abilității lor de a identifica rapid și precis fragmente genetice, aceste abordări „pot găsi un ac într-un cătun”, spune Liu. Ei folosesc diferiți reactivi față de analizele bazate pe RT-PCR – utile când există deficiențe de aprovizionare chimică pentru teste standard – și pot fi proiectate pentru a viza orice agent patogen. De exemplu, o echipă condusă de biologul de calcul Pardis Sabeti de la Broad Institute a creat „cipuri” de cauciuc despre dimensiunea unui smartphone care poate căuta 1.000 de eșantioane pentru un singur virus sau 5 eșantioane pentru un panou de 169 de viruși despre care se știe că infectează oamenii.
Screening de suprafață
O abordare diferită pentru teste diagnostice mai rapide și mai ieftine ar fi să caute molecule care stau pe suprafața virusului, în loc să încerce să detecteze genomul virusului. Un astfel de test ar conține un anticorp adaptat pentru a se lega de o proteină specifică sau un antigen – similar cu tehnologia care permite testarea sarcinii la domiciliu. Aceste teste, care sunt ieftin de produs și ușor de condus, sunt deja utilizate pentru a detecta infecțiile gripei. Însă testele antigene nu conțin o etapă de amplificare în același mod în care fac testele pentru materialul viral, astfel încât acestea sunt mai puțin sensibile.
La 8 mai, FDA a acordat prima autorizație de utilizare de urgență pentru un test de antigen coronavirus care vizează proteina nucleocapsidă de pe suprafața virusului. FDA din Taiwan evaluează un test similar care ar putea oferi rezultate în termen de 20 de minute, spune biologul de calcul An-Suei Yang de la Academia Sinica din Taipei, care a dezvoltat testul. Echipa lui Yang a folosit inteligența artificială pentru a identifica anticorpi care s-ar putea lega de proteine de pe suprafața coronavirusului. Yang spune că cercetătorii nu l-au testat încă pe elantioane de coronavirus de la persoane infectate.
Chiar și odată ce un test funcționează bine în laborator, acesta încă se confruntă cu o călătorie anevoioasă spre utilizarea în masă. Prima provocare este verificarea performanței, deoarece calitatea poate varia. „Este un Vest Sălbatic pentru dezvoltarea testelor”, spune Catharina Boehme, directorul executiv al Fundației pentru diagnostice inovatoare (FIND), un grup non-profit din Geneva care colaborează cu Organizația Mondială a Sănătății și Spitalele Universitare din Geneva pentru a evalua sute de opțiuni de testare SARS-CoV-2. Cele mai multe teste bazate pe RT-PCR pe care FIND le-a evaluat au performanțe la fel de bune ca și standardul de aur, în timp ce testele antigene au scăzut până acum de așteptările, spune Boehme.
Un alt obstacol este extinderea analizelor pentru producția în masă. Având în vedere această constrângere, Boehme consideră că este nerealist faptul că toate noile teste vor fi implementate înainte de sfârșitul anului – deși ar putea fi un număr mic. Dar, odată ce vor fi disponibile, ar putea lucra alături de standardul de aur pentru a împinge țările mai aproape de ținta de milioane de teste pe săptămână – și să pregătească lumea pentru următoarea pandemie.
Chiar și pe parcursul acestei situații, spune Boehme, cercetătorii nu trebuie să neglijeze dezvoltarea testelor pentru alți viruși care provoacă simptome respiratorii și monitorizarea condițiilor precum diabetul, care pot agrava perspectivele pentru persoanele cu COVID-19. „Trebuie să depășim testarea doar pentru coronavirus”, spune ea.
ARTICOLUL ORIGINAL POATE FI CITIT AICI.